Блог

Jan 01, 2024

Исследование расшифровывает путь биосинтеза антидепрессанта орцинол глюкозида

Ученые также разработали производство орцинол глюкозида в

Ученые также разработали производство орцинол глюкозида в биотехнологических дрожжах.

Антидепрессивные свойства орцинол глюкозида (ОГ) хорошо известны. В основном он присутствует в корневище Curculigo orchioides Gaertn, также известного как Xianmao на китайском языке. По показаниям ОГ оказывает разнообразное фармакологическое действие. Согласно некоторым исследованиям, основным ингредиентом C. orchoides, обладающим антидепрессивной активностью, может быть ОГ.

Однако из-за неэффективной экстракции растений, а также сложного и дорогого химического синтеза коммерческое применение ОГ оставалось ограниченным.

Высокоактивная орцинолсинтаза (ORS) и UDP-зависимая гликозилтрансфераза (UGT), участвующие в производстве OG, были обнаружены в этом исследовании с использованием эффективного механизма скрининга. Используя секвенирование транскриптома C. orchioides, компьютерный анализ и функциональную проверку in vitro, исследователи смогли точно определить путь.

Биосинтез OG сначала катализируется ORS, который представляет собой поликетидсинтазу III типа (PKS), посредством конденсации 1 молекулы ацетил-КоА и 3 молекул малонил-КоА с образованием орцинола, который впоследствии модифицируется с помощью UGT по углероду. -3 или углерод-5 гидроксигруппа для образования OG.

Ученые использовали метаболический и сравнительный анализ транскриптома, чтобы изучить функциональные гены, кодирующие ОРС и УГТ у C. orchioides. Они оценили распределение OG и его предшественника орцинола в корнях и листьях C. orchioides. Результаты показали, что содержание OG в основном было в корнях, почти в 3 раза больше, чем в листьях. При этом суммарное содержание ОГ и орцинола в корнях также было выше, чем в листьях.

Ученые также смогли идентифицировать 5 кандидатов на ОРС от других видов на основе сходства последовательностей. Все гены-кандидаты ОРС были охарактеризованы с использованием анализов активности ферментов in vitro с использованием ацетил-КоА и малонил-КоА в качестве субстратов.

UGT, ответственный за образование ОГ у C. orchioides, остается неизвестным. Объединив секвенирование транскриптома, ограниченное молекулярное докинг и функциональную характеристику, мы создали конвейер, позволяющий сузить список генов-кандидатов, кодирующих UGT. Ограничения экспрессии генов и связывания субстратов быстро уничтожили более 90% потенциальных кандидатов.

Затем трудоемкая функциональная проверка потенциальных UGT была проведена только на 6 генах, что позволило избежать утомительного экспериментального тестирования. Этот процесс дает возможность обнаружить новые гликозилтрансферазы и другие функциональные гены в путях биосинтеза натуральных растительных продуктов, что также было применено для создания комплексной базы данных UGT растений pUGTdb.

Чтобы улучшить микробное производство ОГ, ученые в основном учитывали клетки-хозяева, метаболическую инженерию, среду и условия ферментации. Возникающий промышленный микроорганизм Y. lipolytica естественным образом наделен высоким потоком углерода в сторону ацетил-КоА и малонил-КоА. Например, сверхэкспрессия эндогенных генов YlPEX10 и YlACC1, которые использовались для улучшения снабжения ацетил-КоА и малонил-КоА, не улучшала продукцию OG, указывая на то, что поставка предшественников не была ограничивающим фактором.

Действительно, сверхэкспрессия нижестоящих генов (CorcORS1 и CorcUGT31) на пути биосинтеза OG значительно улучшает выработку OG. В то же время мы обнаружили, что выбор подходящей ферментационной среды во многом определяет продуктивность и имеет решающее значение для снижения синтеза побочных продуктов.

После дополнительной оптимизации условий периодической ферментации с подпиткой продуктивность OG в сконструированном штамме YL-G12 была улучшена примерно в 100 раз по сравнению с исходным штаммом YL-G1.

За счет улучшения последующего пути, метаболической инженерии и оптимизации ферментации выработка ОГ в Yarrowia lipolytica была улучшена в 100 раз, в результате чего конечный выход составил 43,46 г/л (0,84 г/г DCW), что почти в 6400 раз выше. чем выход экстракции из корней C. orchioides.